2017年是细胞免疫治疗领域的丰收年。来自Novartis的Kymriah和来自Kite Pharma（Gilead收购）的Yescarta相继获得FDA批准在美上市。中国方面，复星医药牵手Kite Pharma设立合资公司复星凯特，旨在将Kite Pharma的KTE-C19产品技术引进中国。其他国内上市公司如安科生物、佐力药业、冠昊生物等均以不同形式参与CAR-T治疗的市场化推进。

同时，药品医疗器械审评审批制度改革深化的大背景下，细胞治疗行业的申报标准也越来越清晰。中国药审的核心机构药品审评中心（CDE）也在积极筹备细胞免疫治疗产品的审核工作。

然而，不可否认的是，CAR-T治疗面临着制备过程复杂、价格昂贵等生产问题，以及在血液癌症中一定的复发率，和在实体瘤中效果有限等应用问题。对此，研发客专访了宾夕法尼亚大学细胞免疫治疗中心(Center for Cellular Immunotherapies)T细胞工程实验室 (T Cell Engineering Laboratory；TCEL)主任赵阳兵教授。

赵阳兵教授毕业于重庆第三军医大学，获得医学和免疫学博士学位。在肿瘤免疫治疗领域有超过20年的工作经验，并在CAR-T和TCR-T领域有多项重磅级研究成果。同时，他还担任宾夕法尼亚大学Perelman医学院病理和实验医学学院Associate Professor。

CAR-T治疗实体瘤

研发客：CAR-T技术目前在实体瘤中的尝试不是很成功，您觉得原因在哪里？

赵阳兵：目前CAR-T技术在实体瘤上确实处于瓶颈期。其中主要的原因包括三个方面。

一是没有安全的肿瘤特异性抗原靶，因此一般治疗病人的CAR-T细胞剂量太低，无法看到真正疗效；二是由于大多数实体肿瘤的异质性，很难有病人身上的所有（或绝大多数）肿瘤细胞都表达同一个靶，不像血液系统的肿瘤靶，如CD19、BCMA、CD123等。三是很多肿瘤的肿瘤微环境抑制机制很强，有时T细胞根本就到不了肿瘤部位，即使到了肿瘤部位其功能也可能会很快被抑制，甚至会变成肿瘤的帮凶。

研发客：最近有一些报道里提到肿瘤内注射，肿瘤内注射CAR-T细胞是否可行？

赵阳兵：关于肿瘤瘤内注射的话题，我认为对脑肿瘤以外的其他肿瘤，尤其是有转移的肿瘤意义不大。由于脑肿瘤很少发生远端转移，局部注射还是可取的治疗手段。但其他种类的肿瘤，一旦转移会有非常多的转移病灶，这种情况下很难再进行瘤内注射。目前T细胞免疫治疗主要用于晚期转移肿瘤病人，瘤内单纯注射CAR-T细胞真正用于治疗实际意义非常有限。因此，这种方法只能作为临床研究，探索T细胞对于肿瘤的抑制功能。另外，如果CAR-T联合其他疗法使用，比如瘤内注射CAR-T和DC细胞，很可能CAR-T细胞杀死肿瘤细胞后可以释放肿瘤抗原，这些抗原可以被注射的DC细胞俘获，从而产生局部免疫反应和联合效应。

研发客：您觉得CAR-T技术治疗实体瘤的突破口在哪里？

赵阳兵：在我看来，CAR-T技术治疗实体瘤突破口需要解决上面的三大问题：首先寻找安全的靶，在不安全的靶上加开关意义不大，在相对安全的靶，甚至安全的靶上加开关倒是很有意义。其次，靶向多靶点很有必要，可以有效防止肿瘤的免疫逃避。最后，CAR-T的联合治疗是让CAR-T真正有效的重要途径，也许是唯一途径。联合的方案很多，包括对T细胞的进一步修饰，如加PD1-CD28 转换受体、CRISPR敲除PD1等。也可以是联合其他抗肿瘤药，如免疫检查点抗体。也可以是联合肿瘤疫苗，比如RNA疫苗、DC疫苗等。也许需要综合这些所有的措施。这些都需要很多的研发工作和临床试验来验证，需要大家的努力。

通用型CAR-T离产业化有多远

研发客：我们知道您的实验室已经成功开发了通用型CAR-T并在临床前模型中得到验证。我们是否有一天能做成通用的CAR-T产品，从而降低生产时间和成本？

赵阳兵：2013年CRISPR技术一出来，我们就开始尝试使用这项技术制备通用型CAR-T。2014年我们就实验成功并申请了专利。2016年作为人类首例CRISPR基因编辑技术的临床试验通过了RAC 审批。通用型CAR-T产品的制备已经不存在技术问题。但是很可惜由于其他的原因，我们没能及时把通用CD19CAR-T用于临床。目前，我们将CRISPR技术应用到NY-ESO-1TCR-T这个项目。这个项目主要是在T细胞中敲除内源性TCR和PD-1，转入靶向NY-ESO-1的TCR到T细胞内。这个项目的临床试验申请刚刚获得了美国FDA批准，这也是美国第一个使用CRISPR基因编辑技术的临床试验，将于年底开展临床试验。

但这个项目并不是所谓的通用型CAR-T。通用型CAR-T进展最快的是Cellectis公司。根据他们已经发表的数据，初步临床试验结果不如预料的好。我们理想的通用型CAR-T是同时敲除TCR和HLA-I，这样保证输注的异体T细胞既不会杀伤宿主也不会被宿主很快排斥。

但是我认为通用型CAR-T还是有很多问题尚待解决。

研发客：通用型CAR-T的难点在哪里？

赵阳兵：首先，一般通用型CAR-T是在敲除TCR后，对T细胞进行CD3的负性筛选。目前的筛选方法，筛选效率比较高，可以达到99%的纯度。即使是这样，也不能保证剩余的极少量的CD3阳性细胞不产生移植物抗宿主反应（GVHD）。因为这些细胞是转了CAR的，在体内还可能会扩增导致杀伤作用的放大。因此，如果要应用通用型CAR-T，就要权衡输入细胞的数量与疗效。输入的总细胞越少，里面包含的CD3阳性细胞越少，就越安全，但是疗效可能会受到影响。我们不希望看到的是GVHD的发生，因为一旦发生就会有很大的临床安全隐患。另外，使用通用型CAR-T的临床方案设计也很重要。

其次，让异体CART达到自体CART的效果可能还需要一段时间。主要解决的问题首先是异体排斥的问题。虽然通用型CAR-T进行了一些基因改造，但是不能保证一定不会被宿主排斥掉。我们知道对于CAR-T来讲，T细胞的持久性（persistence）对于临床疗效非常重要。首先，如果敲除了HLA-I，第一个担心就是NK细胞的清除。但是如果不敲除HLA-I，则会被宿主的免疫系统很快清除掉。哪种更不容易被清除掉，可能真正到了临床试验阶段来进行对比，才能给出结论。其实在一些研究中，敲除了HLA-I的异体细胞可以再转一个排斥较小的特殊的HLA-E。这样的话就不会被NK细胞清除了。当然，这里面策略很多。我们在以前的文章中也描述的很详细了。

另外，T细胞产品的产量和质量也会是通用型CART产业化要考虑的重要问题之一。我们都希望找到通用型CAR-T合适的细胞供体。理想的供体是越“年轻的”T细胞越好。目前已经有很多策略，比如使用干细胞、ips等。还有优化T细胞激活的策略，包括使用不同的细胞因子等。在这方面我们实验室也有很多研究工作。在治疗实体肿瘤上，这可能成为瓶颈，因为实体瘤CAR-T用量大，一个供者的T细胞量也许只够治疗一个病人，这样的话其实成本比用自体还要高。

TCR-T技术的难点和瓶颈

研发客：我们知道您实验室很大一部分工作是在研究TCR-T。与CAR-T相比，TCR-T在治疗实体肿瘤的应用前景如何？

赵阳兵：与CAR-T相比，TCR-T 的优点是可以靶向被MHC提呈的细胞内的抗原。因此，在靶点选择上具有天然优势。我们知道有一类蛋白叫做Cancer testis antigen，这类蛋白一般在胚胎发育早期表达，胚胎发育完成后就只在具有免疫屏障的睾丸内表达。而在肿瘤细胞内，这些蛋白会重新表达。因此以这类蛋白为靶点的TCR-T会更加安全。这其中NY-ESO-1就是一个典型代表。而且NY-ESO-1 TCR最早是我在NIH开展研究的。根据目前的临床试验结果，NY-ESO-1 TCR-T的临床效果和安全性都比较好。在MultipleMyeloma和Synovial sarcoma等，总体有效率可以达到30%-50%。针对Multiple Myeloma效果尤其好。用TCR-T的主要局限性是受到抗原提呈的HLA种类限制。另外，很多肿瘤可以通过很多途径降低HLA表达从而逃避TCR-T的攻击。

研发客：TCR-T技术的难点和瓶颈在哪里？

赵阳兵：TCR-T也有一些尚待解决的问题。首先是大多数天然筛选到的TCR一般活性较弱。通过基因突变的方法可以提高TCR的亲和力和活性，但是，根据目前的数据和我们的经验，大多数高亲和力的TCR特异性会明显下降，从而导致其靶向性下降而产生严重的临床毒性。其次，肿瘤细胞通过下调HLA表达等的逃逸机制也会限制TCR-T的临床效果。除此之外，肿瘤抑制性微环境也是TCR-T要解决的问题之一。CAR-T也好，TCR-T也好，如果要应用于实体瘤，都要解决实体瘤抑制性微环境的问题。

我们实验室主要采用的方法是敲除内源性TCR、敲除PD-1等，敲除内源性TCR可以增加转基因TCR的亲和力，而敲除PD-1可以降低肿瘤免疫微环境的抑制。另外一点，也是我们实验长期在做的，就是使用PD1-CD28 switch-receptor等融合分子。这类分子可以将肿瘤微环境抑制性信号转换为激活性的信号。我们已经在动物模型中发现，加了switch-receptor的T细胞在肿瘤微环境内扩增更好，活性更高。当然，这是在动物模型中的结果，我们很期待在临床试验中看到效果。

我们实验室主要是通过修饰T细胞的方法来促进其疗效。很多其他的研究，比如用TCR-T与PD-1抗体联用，或者与其他免疫调节分子，比如IDO抑制剂联用等等，这些联合治疗的临床结果也非常值得期待。

与泰斗同行

赵教授与细胞免疫治疗领域泰斗级专家Steven Rosenberg教授和Carl June教授并肩工作数年。作为免疫治疗领域转化探索的先行者，赵教授与CarlJune教授一起主导创立了Tmunity Therapeutics公司，为细胞免疫治疗产品从实验室到临床试验再到市场铺平道路。

研发客：您和细胞免疫治疗先驱Carl June教授和Steven Rosenberg教授都有数年的合作经历。能否简单评价一下两位教授？

赵阳兵：Rosenberg教授是基因治疗和肿瘤细胞免疫治疗的先驱， 是他第一个把转基因T细胞用于病人。他一直是肿瘤T细胞免疫治疗的领导者，从早期的LAK（Lymphokineactivated killer cells）细胞、TIL（Tumorinfiltrating lymphocytes）、CAR-T、 TCR-T到新抗原T，他都是第一个做临床试验的。他可以被称为肿瘤T细胞免疫治疗领域的鼻祖或祖师爷。他不仅开创了这个领域，而且一直带领着这个领域，后劲十足。谈到他个人，他是一个不图名利而为科学献身的真正的科学家。他可以说桃李满天下。他的很多学生都在学术界或商界很有成就，而他在NCI担任外科主任三十多年如一日，专心研究，不为名利。无论交谈还是做报告，简明扼要通俗易懂，个人魅力十足。

Carl June教授免疫学功底扎实，对T细胞共刺激分子的研究，尤其是CD28，有突出的贡献。他也有很多个第一，比如：第一个用CAR-T 细胞治疗病人（HIV感染病人）；第一个用慢病毒载体改造的细胞治疗病人；第一个用基因编辑技术(ZFN) 治疗HIV病人；第一个用RNA电转T细胞治疗病人；第一个被批准使用CRISPR技术治疗病人；第一个让CAR-T商品化。如果说是Rosenberg教授开创了T细胞免疫治疗领域，那么是 June教授促成了T细胞免疫治疗的产业化。

人物简介

赵阳兵教授1996年作为访问学者在以色列魏茨曼科学研究所（Weizmann Institute of Science）从事基因工程T细胞诱导骨髓移植免疫耐受的研究。2000年，他来到美国杜克大学医学中心，开展RNA介导的肿瘤DC疫苗研究。2003年，他加入细胞免疫治疗先驱Steven Rosenberg实验室。在NIH工作的五年时间里，他主导研发了靶向肿瘤抗原NY-ESO-1的TCR和靶向Her2/Neu的三代CAR，并把这两项突出成果推进到临床阶段。此外，他还开发了靶向CD19和VEGFR等的TCR-T和CAR-T治疗技术，推动了相关临床试验的进行。

2009年，受另一位细胞免疫治疗先驱CarlJune教授邀请，赵教授来到宾夕法尼亚大学转化医学研究中心，建立了T细胞工程实验室，专心研究如何改造自体和制备异体的安全有效的T 细胞用于肿瘤免疫治疗，开创性地将CRISPR/CAS9技术应用于TCR-T 和CAR-T领域。2016年6月，他领导的人类首例CRISPR临床试验全票通过了NIH Recombinant DNA Advisory Committee (RAC)审批，并于2017年12月通过了FDA的IND 申请（详情见https：//www.nature.com/news/first-crispr-clinical-trial-gets-green-light-from-us-panel-1.20137）。

赵教授与来自美国、德国、以色列和中国等的多个顶级研究单位开展国际合作。也一直关注中国细胞免疫治疗领域的发展，多次在中国举办的国际学术会议中做报告，介绍分享成功经验，助推中国细胞免疫治疗领域的发展。

目前，赵教授的实验室以实际应用为导向，以解决临床需求为目标，在细胞免疫治疗领域有非常多的新技术和新疗法在不断被开发出来。其中针对前列腺癌、胃癌、肝癌、间皮瘤、胰腺癌、乳腺癌和神经胶质瘤等多种实体瘤的细胞免疫治疗都已经进入关键临床试验阶段。

代表性文章及解读

1. Multiplex Genome Editing to Generate Universal CAR T Cells Resistantto PD1 Inhibition. Ren J， Liu X， Fang C， Jiang S， June CH， Zhao Y. Clin CancerRes. 2017 May 1；23(9)：2255-2266.

运用CRISPR基因编辑技术成功制备Universal CAR-T和敲除免疫检查点PD-1的CAR-T细胞。该工作是宾夕法尼亚大学开展的全美首个CRISPR临床试验的基石。

2. A Chimeric Switch-Receptor Targeting PD1 Augments the Efficacy ofSecond-Generation CAR T Cells in Advanced Solid Tumors. Liu X， Ranganathan R，Jiang S， Fang C， Sun J， Kim S， Newick K， Lo A， June CH， Zhao Y， Moon EK.

Cancer Res. 2016 Mar 15；76(6)：1578-90.

包含PD-1膜外区和CD28膜内区的嵌合抗原受体成功帮助CAR-T细胞突破抑制性肿瘤微环境，大大增加了CAR-T细胞对肿瘤的杀伤效果。

3. Affinity-Tuned ErbB2 or EGFR Chimeric Antigen Receptor T Cells Exhibitan Increased Therapeutic Index against Tumors in Mice. Liu X， Jiang S， Fang C，Yang S， Olalere D， Pequignot EC， Cogdill AP， Li N， Ramones M， Granda B， Zhou L，Loew A， Young RM， June CH， Zhao Y. Cancer Res. 2015 Sep 1；75(17)：3596-607.

亲和力优化的ErbB2和EGFR CAR-T可以特异性识别肿瘤细胞，避免了对正常组织细胞的杀伤。

4. Multiple injections of electroporated autologous T cells expressing achimeric antigen receptor mediate regression of human disseminated tumor. ZhaoY， Moon E， Carpenito C， Paulos CM， Liu X， Brennan AL， Chew A， Carroll RG，Scholler J， Levine BL， Albelda SM， June CH. Cancer Res. 2010 Nov 15；70(22)：9053-61.

电转CAR-T细胞的应用

5. A herceptin-based chimeric antigen receptor with modified signalingdomains leads to enhanced survival of transduced T lymphocytes and antitumoractivity.

Zhao Y， Wang QJ， Yang S， Kochenderfer JN， Zheng Z， Zhong X， Sadelain M，Eshhar Z， Rosenberg SA， Morgan RA. J Immunol. 2009 Nov 1；183(9)：5563-74.

全球首个由Herceptin改造的抗HER2 三代CAR-T。

6. Construction and preclinical evaluation of an anti-CD19 chimericantigen receptor. Kochenderfer JN， Feldman SA， Zhao Y， Xu H， Black MA， MorganRA， Wilson WH， Rosenberg SA. J Immunother. 2009 Sep；32(7)：689-702.

Rosengberg实验室使用的抗CD19CAR-T的临床前研究成果。该研究为以后的临床试验奠定基础，也是KitePharma已上市产品Yescarta的原型。

7. Primary human lymphocytes transduced with NY-ESO-1 antigen-specificTCR genes recognize and kill diverse human tumor cell lines. Zhao Y， Zheng Z，Robbins PF， Khong HT， Rosenberg SA， Morgan RA.

J Immunol. 2005 Apr 1；174(7)：4415-23.

全球最早的NY-ESO-1 TCR-T的发现和临床前研究。

代表性专利

1、WO2004016803    Method of enhancing CD4+ T cell responses

2、WO2013126726    DOUBLE TRANSGENIC T CELLS COMPRISING A CARAND A TCR AND THEIR METHODS OF USE

3、WO2013126720    COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE ASSESSMENTOF TARGET CANCER CELL RESISTANCE TO CAR ENGINEERED T CELL KILLING

4、WO2013126712    Compositions and Methods for Generating aPersisting Population of T Cells Useful for the Treatment of Cancer

5、WO2013126733 A1   USE OF ICOS-BASED CARS TO ENHANCE ANTITUMORACTIVITY AND CAR PERSISTENCE

6、WO2013040557    RNA ENGINEERED T CELLS FOR THE TREATMENT OFCANCER

7、WO2013019615    SWITCH COSTIMULATORY RECEPTORS

8、WO2014011988 A3    Enhancing Activity of CAR T Cells byCo-Introducing a Bispecific Antibody

9、WO2014011993 A2   EPITOPE SPREADING ASSOCIATED WITH CAR T-CELLS

10、WO2015142675 A2   TREATMENT OF CANCER USING CHIMERIC ANTIGENRECEPTOR

11、WO2015112626 A8   Enhanced antigen presenting ability of car tcells by co-introduction of costimulatory molecules

12、WO2016070061 A1   Methods and compositions for modified t cells

13、WO2016069282A1     Altering gene expression in cart cells anduses thereof

14、WO2016069993 A1   Compositions and methods of stimulating andexpanding t cells

15、WO2016122738A1     Compositions and methods for t celldelivery of therapeutic molecules

(世联博研(Bioexcellence)世联博研Bioexcellence）