病毒特异性T细胞适应性免疫是消灭HIV感染细胞的关键，而且对于任何实现治愈HIV感染的战略方法都至关重要。HIV潜伏感染的细胞（潜伏病毒库）甚至在数十年的抗逆转录病毒药物组合（cART）用药抑制血浆病毒血症后仍然存在。这种潜伏病毒库的持久性和持续性排除了仅靠cART治疗根除HIV的可能性。

在没有cART治疗的情况下实现HIV的治愈或持续缓解，将需要增强的和持续有效的抗病毒免疫反应。嵌合抗原受体（CAR）T细胞（CAR-T）已成为一种强大的免疫疗法，并显示出治疗HIV感染的前景。在许多此类基于外周血T细胞修饰的方法中，经过修饰的T细胞的持久性、组织输送和功能维持仍是一大挑战。

在之前的研究和临床试验中，第一代CD4CAR（基于全长CD4构建出的CAR）的一种不好的特性是CD4受体本身能够介导HIV感染。CD4分子含有4个细胞外结构域，依次命名为D1、D2、D3和D4。D1结构域离跨膜结构域最远，含有HIV包膜结合区。HLA II类结合位点主要在D1和D2结构域发现。D4结构域介导IL-16结合和CD4-CD4二聚化。IL-16是一种免疫调节性的细胞因子，主要在炎症位点作为CD4细胞的趋化因子发挥作用。在第一代CD4CAR中，IL-16在D4结构域上的结合可导致基于IL-16的潜在非特异性的CD4CAR信号转导。CD4受体的D3结构域也在TCR:CD4复合物形成和TCR刺激中发挥重要作用。为此，需要开发一种不与IL-16发生交叉反应的降低与HLA II和内源性TCR之间相互作用的CAR，从而潜在地增加CAR的安全性。

为了克服这些问题，来自美国加州大学洛杉矶分校的研究人员在一项新的研究中，利用基于造血干细胞（HSC）的方法开发并测试了第二代基于CD4的CAR（下称D1D2CAR）抵抗HIV感染。在第二代CD4CAR中，他们剔除了CD4的D3和D4结构域，仅留下允许HIV包膜识别的D1和D2结构域，从而制造出截断的CD4CAR分子，即D1D2CAR。相关研究结果于2021年4月2日发表在PLoS Pathogens期刊上，论文标题为“Robust CAR-T memory formation and function via hematopoietic stem cell delivery”。

在体外实验中，这些作者发现表达第一代CD4CAR导致HIV成功地感染宿主细胞，相反之下，表达D1D2CAR并不允许宿主细胞被HIV感染。这表明尽管能够结合HIV包膜，但是D1D2CAR并不允许病毒入侵宿主细胞。更重要的是，表达第一代CD4CAR的T细胞（下称CD4CAR-T）和表达D1D2CAR的T细胞（下称D1D2CAR-T）对HIV感染细胞表现出相当的细胞杀伤活性。这表明D1D2CAR在功能上能够诱导与第一代CD4CAR类似的抗病毒反应。

D1D2CAR不能介导HIV感染。图片来自PLoS Pathogens, 2021, doi:10.1371/journal.ppat.1009404。

鉴于第一代CD4CAR在造血干细胞中的表达导致大约一半由造血干细胞分化而来的CAR-T细胞抑制TCR重排和表面表达，这些作者利用植入经过慢病毒转导表达D1D2CAR的造血干细胞的人源化BLT小鼠，发现D1D2CAR并不影响胸腺淋巴细胞产生期间的内源性TCR重排，阻止造血过程偏向于B细胞产生，并且导致正常的CAR-T细胞产生。因此，D1D2CAR表达不影响T细胞分化和TCR表达。

为了研究由造血干细胞分化产生的D1D2CAR-T细胞是否能够在体内抑制HIV复制，这些作者让植入未经修饰的造血干细胞（作为对照）或经修饰后表达第一代 CD4CAR 或D1D2CAR的造血干细胞的人源化BLT小鼠被HIV感染10周。在HIV感染后每两周检测血浆病毒载量。相比于对照小鼠，植入表达第一代 CD4CAR 或D1D2CAR的造血干细胞的小鼠在10周内表现出较低水平的病毒载量。然而，由造血干细胞分化产生的CD4CAR-T细胞通过IL-16介导的CD4-CD4二聚化对Env+靶细胞（即表达HIV抗原Env的靶细胞）和IL-16刺激作出反应，相比之下，由造血干细胞分化产生的D1D2CAR-T细胞仅对ENV+靶细胞作出反应，而不对可溶性IL-16作出反应。

共刺激结构域4-1BB增强CD4CAR-T细胞的功能。图片来自PLoS Pathogens, 2021, doi:10.1371/journal.ppat.1009404。

之前的研究表明给CAR添加共刺激结构域可能会促进CAR阳性细胞更快速产生初级反应，但是这种添加对造血干细胞定植和胸腺淋巴细胞产生的影响是未知的。为此，这些作者构建出含有4-1BB或CD28共刺激结构域的第一代CD4CAR和D1D2CAR，然后将表达第一代CD4CAR、 D1D2CAR、 第一代CD4CAR-41BB、D1D2CAR-41BB、第一代CD4CAR-CD28或 D1D2CAR-CD28的造血干细胞移植到人源化BLT小鼠的骨髓中，发现4-1BB共刺激结构域而不是CD28共刺激结构域允许成功的造血分化，并改善由造血干细胞分化而来的CAR-T细胞的抗病毒功能。加入4-1BB可导致更快速的病毒血症抑制。D1D2CAR 4-1BB和cART联合使用可导致这些小鼠更快实现病毒抑制，而且在ART治疗期间，CAR-T细胞更持久地存在。

这些结果表明D1D2CAR-41BB是一种性能优异的CAR，表现出比第一代CD4CAR更好的造血干细胞分化、病毒抑制、CAR-T 细胞持久性、更少的有害功能，应继续作为临床研究的候选药物。（生物谷 Bioon.com）

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