人们对嵌合抗原受体（CAR）T细胞（CAR-T）治疗实体恶性肿瘤的前景产生了极大的兴趣，多项临床试验正在进行中。然而，由于缺乏肿瘤特异性靶点，这些临床试验的范围受到了限制。一旦与抗原结合，CAR就会启动强劲的T细胞激活，随后通过通常包含CD3ζ和共刺激序列元件的细胞内信号转导结构域对靶细胞进行杀伤。肿瘤特异性对于CAR疗法的成功和安全使用至关重要。静脉注射抗ErbB2 CAR-T细胞导致了转移性结肠癌患者出现致命性毒副作用，因为CAR-T细胞在肺部激活后出现了不受控制的细胞因子释放综合症（细胞因子风暴）。然而，ErbB受体仍然是有吸引力的肿瘤相关靶点，因为它们在许多癌症中都有表达或过度表达。

在一项新的研究中，英国研究人员研究了利用肿瘤缺氧作为CAR-T细胞在肿瘤微环境（TME）中特异性激活的物理线索的机会，其中肿瘤缺氧是大多数实体瘤的共同特征。他们发现，在严格的缺氧感应安全开关（hypoxia-sensing safety switch）的控制下表达CAR，可以避免CAR-T细胞的非肿瘤组织在靶激活（on-target, off-tumor activation，即脱靶激活），同时提供高效的抗肿瘤杀伤。这项研究提供了一种方法来克服利用CAR-T细胞治疗实体恶性肿瘤的一个主要障碍。相关研究结果发表在2021年4月20日的Cell Reports Medicine期刊上，论文标题为“Hypoxia-sensing CAR T cells provide safety and efficacy in treating solid tumors”。

为了研究CAR-T细胞脱靶激活的问题，这些作者使用了第二代泛抗ErbB CAR T1E28z，即T4-CAR，它对9种可能的ErbB受体同源和异源二聚体中的8种具有特异性，并能跨越物种屏障，与人类和小鼠ErbB受体等效结合。T4-CAR共同表达一种嵌合细胞因子受体（4αβ），当与IL-4结合时，就将IL-2/IL-15信号传递到细胞外结构域，从而提供了一种在体外扩增时选择性地富集CAR-T细胞的方法，而不影响这些细胞的CAR依赖性杀伤能力。T4-CAR已被证明对头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）患者的瘤内递送是安全的，但治疗转移性疾病的患者需要静脉注射。

然而，在临床前，将人T4-CAR-T细胞输注到携带表达ErbB1-4的HN3肿瘤的NSG小鼠体内，可导致致命的毒性，这些动物的体重迅速下降就是证明。正如在临床上观察到的那样，这些小鼠的血液分析显示了细胞因子风暴的证据。通过使用亚致死剂量的同时表达荧光素酶（Luc）的CAR-T细胞，这些作者评估了这些细胞在静脉输注后的急性生物分布。成像显示，大部分注入的CAR-T细胞聚集在肺部和肝脏，而只有少数细胞到达肿瘤，尽管肿瘤细胞上有ErbB1-4的表达。对ErbB1-4 mRNA表达的分析证实，所有四种受体（即ErbB1-4）都在所有重要器官中表达，包括在肺部和肝脏。经过T4-CAR-T细胞灌注的小鼠的肝脏和肺部组织的苏木精和伊红（H&E）染色切片显示存在髓样细胞浸润，表明这些组织中存在CAR介导的炎症。这些数据表明，肝脏和肺部是肿瘤外CAR T细胞激活的两种关键器官。

静脉注射的T4-CAR-T细胞会引起健康器官的炎症，图片来自Cell Reports Medicine, 2021, doi:10.1016/j.xcrm.2021.100227。

为了开发一种严格的缺氧调控的CAR表达系统，这些为T4-CAR开发了一种双缺氧感应方法。这是通过在CAR上附加缺氧诱导因子HIF1α羧基末端长203个氨基酸的氧依赖性降解结构域（oxygen-dependent degradation domain, ODD）来实现的，同时在载体的长末端重复序列（LTR）增强子区域修改CAR的启动子，使其包含一系列连续的9个缺氧反应元件（9xHRE），从而允许HIF1α介导的CAR转录。这种称为HypoxiCAR的CAR在体外显示了CAR分子在人类T细胞细胞表面上的严格的缺氧特异性表达。表达HypoxiCAR的T细胞（下称HypoxiCAR-T细胞）在低氧（0.1% O2）条件下激活时，每个细胞表达的CAR分子与组成型T4-CAR-T细胞相当。事实证明，整入HypoxiCAR的双缺氧感应系统优于9xHRE盒（9xHRE cassette）或ODD的单缺氧感应模块，后者在常氧条件下表现出CAR表达和肿瘤细胞杀伤的不严密性。使用双缺氧感应系统的HypoxiCAR的表达严格限制在缺氧环境中，同时也是高度动态的，这代表了一种可以以O2依赖的方式开启和关闭的开关。

这种双缺氧感应系统作为一种实现癌症选择性免疫治疗的替代方法，利用了肿瘤微环境的最固有的特征之一：缺氧。它取得了令人信服的抗肿瘤疗效，同时消除了识别正常组织中多个靶点时出现的脱靶毒性。渗入肿瘤微环境的T细胞可以向外迁移，这突出了一个潜在的安全问题：感应缺氧的HypoxiCAR-T细胞有可能重新进入健康的常氧组织。然而，CD8+T细胞迁移已被证明在遇到表达其同源抗原的肿瘤细胞时停止，这表明，当HypoxiCAR-T细胞表达它们的CAR并与表达ErbB受体的肿瘤细胞接触时，它们向外迁移的能力可能受到限制。此外，根据这些作者的体外观察，CAR的表达在可能离开肿瘤时迅速减少，从而大大限制了注入的CAR T细胞在肿瘤外被激活的风险。

HypoxiCAR-T细胞设计和作用机理，图片来自Cell Reports Medicine, 2021, doi:10.1016/j.xcrm.2021.100227。

缺氧的肿瘤微环境不利于有效的免疫反应，在那里，缺氧可以激活诸如巨噬细胞之类的基质细胞的免疫抑制程序，调节免疫检查点分子的表达，并促进更具侵袭性的肿瘤细胞表型。然而，令人鼓舞的是，这些作者发现缺氧并没有对体外的T细胞效应功能产生负面影响。HypoxiCAR-T细胞也能阻止缺氧性肿瘤的生长，这表明在测试的模型中，肿瘤微环境并不是HypoxiCAR效应功能的绝对障碍。尽管这项研究中使用的HypoxiCAR-T细胞剂量并没有完全根除SKOV3肿瘤，但肿瘤控制的丧失与驻留在小鼠体内的HypoxiCAR-T细胞数量的明显下降相吻合。另外，与HN3肿瘤相比，SKOV3肿瘤诱导较低的CAR总体表达，这与SKOV3肿瘤的缺氧程度相对较低一致。这些观察结果突出了适当选择接受HypoxiCAR-T细胞的剂量和个体以实现高效的抗肿瘤控制的重要考虑。

重要的是，鉴于这些作者也证实了HIF1α稳定化程度最高和/或强度最高的肿瘤并未排除T细胞进入上皮之间的间隙，也未排除T细胞进入肿瘤的HIF1α稳定化区域，因此很可能HypoxiCAR-T细胞应该能够进入合适的肿瘤微环境以激活CAR的表达。虽然他们没有观察到接受高治疗剂量的HypoxiCAR-T细胞输注的小鼠存在治疗限制性毒性的证据，但是在健康组织中存在一些微环境，比如在肠道粘膜中已观察到“生理性缺氧”。然而，可以在HypoxiCAR中加入一个额外的自杀开关，为临床试验提供额外的安全水平。

由此可见，HypoxiCAR提供了一种严格的、广泛适用的策略，以克服治疗实体恶性肿瘤的安全靶点缺乏的问题。（生物谷 Bioon.com）

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