引子

最近，Grail准备投资10亿美元计划招募7000初诊癌症和3000 健康人群，致力于肿瘤血检早期诊断标记物的开发[1]。肿瘤血液检测要爆发了吗？

从技术外行和使用者的角度吐槽一下肿瘤液体活检的进展和前景。抛砖引玉。

正文

肿瘤液体活检与传统组织活检的优劣势比较

前年初参加肿瘤液体活检会议的时候，还觉得它离实际应用还远，FDA的指南也含糊其词。一年多过去，已经有多款液体活检伴随诊断产品获FDA批准，或已经得到众多临床数据，准备审报了。液体(血清) 活检的发展真是可以用日新月异来形容。

液体活检主要包括血液中的循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs)， cell-free DNAs (cfDNA)， 外泌体（exosome）等。CTCs 火了几年，在2013年到达高峰后发现应用有许多局限，被迅速崛起的cfDNA取代。外泌体发现还比较新，虽然发展迅速，但离应用还有距离。这里主要讨论cfDNA的进展，主要是伴随诊断和药物疗效实时跟踪方面的应用。

血检与组织检测相比优势在于：方便，快速，即时，便宜，微创。

更重要的是，血检能够挽救许多组织样品难以获得 (when tissue is an issue)，或组织样品数量、质量不高的患者获得靶向疗法，或参与临床研究的机会。比如，完成超过30，000临床测试的Guardant Health报道，血检方法挽救了高达50.2%的临床患者的靶向突变基因的信息，这些患者要么组织样品难以获得，要么样品质量不高，没有检测到致癌突变。

不是所有肿瘤细胞都会将突变的碎片DNA释放到血液中，不同种类的肿瘤的血检检出率也不一致。据Guardant Health的报道，肝癌检出率最高，约为92%，非小细胞肺癌89%，最低的胶质母细胞瘤检出率只有57%。这是血检的最大的限制性硬伤之一。也是组织活检永远都有价值的依据所在 (仍旧是金标准)。

血清cfDNA检测还有许多其它挑战性因素，比如：

·        DNA片段小，50-200 bp（峰值165 bp）。

·        半衰期短，30 分钟，之后稳定。

·        低含量/丰度：低nM/mL 血清。

·        随着治疗效果的增加，肿瘤DNA比例大幅减少。

·        正常细胞DNA的污染。

血检在非小细胞肺癌的应用

随着技术的不断进步，肿瘤血检已经取得巨大的成功。肿瘤血检进展最快和最成熟的也是有着最迫切需求的是肺癌靶向疗法的伴随诊断。肺癌病人多，死亡率高，靶向药物研发进展快。同时肺癌组织取样困难，危险，容易诱发并发症。肺癌临床医生和患者对血检的需求是最积极的。

肺癌血检进展最快的是EGFR敏感突变的检测。EGFR突变在欧美人群占非小细胞肺癌的15%以上，是个比较多的患者人群。在国内比例高达25%以上。FDA去年已经批准了Roche的cobas血检试剂盒用于一线EGFR突变的酪氨酸激酶小分子伴随诊断 (2016-6-1)，以及二线三代AZD9291（TAGRISSO）的伴随诊断 (2016-9-28)。根据已经发表的EGFR T790M阳性患者的数据，组织活检得到的临床试验数据总体应答率（ORR）为62%，无进展生存期（PFS）为9.7个月，血检的ORR为63%，PFS为9.7月。二者数据非常吻合[2]。血检与组织活检一致性也很高。许多其它的公司产品中都包含EGFR的突变检测。

部分商品化血检试剂盒汇总

阿斯利康 (AZD) 花费了大量的精力来检测三代AZD9291的获得性耐药突变机制，最新的报告数据显示约有20%的耐药突变由C797S突变组成 (100 例患者数据)，即突变了AZD9291的共价结合位点。这个比例比以前的报道要低[3]。期待后续的组织活检数据报道，可以比较二者的一致性。其它的突变多为零散分布。同时，AZD也在检测内在 (原发) 突变机制，更多的数据在今年的AACR上应该有更新。

至于用NGS多组合(panel) 检测，Guardant Health 在推出Guardant 360后，又进一步推出Guardian 500+， 与多个大型制药公司合作，用于临床检测，筛选潜在的肿瘤相关突变基因。这与NCI正在进行的伞式（umbrella）和篮式（basket）临床试验的目标是吻合的。即大规模筛选患者人群的可靶向突变，推进，加速靶向药物的使用和开发进程。当然，组合也不是越大越好，如果入选的突变基因不是驱动致癌突变，或者不可靶向，不能对治疗提供诊断意义，意义或许不大，徒增成本。

NGS panel与PCR方法相比，代表了未来更先进的技术。当前，使用者用不同公司的产品得出的结果差异性还很大[4]。AZD的肿瘤转化部门的VP Carl Barrett 甚至给出了几种主流产品20%吻合率的值，令人大掉下巴。Barrett提到，正在用商品化的血清和组织样品来比较不同公司的产品的可靠性，结果可能会在今年AACR年会上公布。看来，相比PCR的方法，NGS在血检上还需要进一步继续提高敏感性和一致性。 

从辉瑞公布的ALK 融合突变3代ALK抑制剂Lorlatinib的血清cfDNA ALK突变临床数据，我们能够得到哪些有用的信息呢？他们用的是BEAMing dPCR 的方法[5]。明显感到作者对方法的灵活性非常不满，因为ALK的耐药突变种类较多，得随着临床进展不断调整PCR引物和反应条件。

从38例患者的血清cfDNA中，检测到有14例患者有ALK耐药突变。这个比例与以前报道的组织检测数据相当。同时，ALK的突变种类，比例分布模式也与以前的报道类似。

血清活检与以前的组织活检相比，能够检测到更丰富的信号。肿瘤突变的异质性再次得到验证。以前组织检查的结果，多数耐药突变为ALK单一突变，只有个别是双突变。但血清检测到的结果则显示，有一半的患者的ALK耐药突变等于或多于2个突变，最多的有4个突变。

Lorlatinib的ALK活性大幅提高，比一代ALK抑制剂Crizotinib的活性提高了20-50倍，临床前数据表明，它能够克服几乎所有的ALK耐药突变，特别对门控突变L1196M有极高的活性。但令人困惑地是，在所有包含L1196M的六例突变患者中，有三例属于有效反应，另外三例效果不佳。根据以前的报道，效果不佳的患者，有很大的可能性是由于Src活性增加造成的内在抗药机制叠加引起的[6]。Src磷酸化活性增加难以用基因检测的方法观察到，只能借助蛋白组学的信息。这也从侧面反映出基因检测不是万能的，还要与其它有效的方法借鉴，互补。

Lorlatinib的ALK耐药突变有一例报道，即L1198F[7]。（血清活检的结果中还没有发现同样的突变）这个新的耐药突变不能被二代ALK抑制剂克服，却对一代ALK抑制剂Crizotinib极其敏感，从而形成一个良性循环 (loop) 用药选择，把恶性肿瘤转化成可控制的慢性病。这应该是在发现最终治愈手段之前我们对靶向疗法期望中理想的“小目标”了。

血检在结直肠癌、肠胃癌上的应用

除了肺癌，晚期转移性结直肠癌（mCRC）是血检发展较快的。即KRAS突变的检测。它不是用于KRAS本身的靶向（还没有有效的直接靶向药物，药物化学家加油！），而是用来指导EGFR抗体用药 (如cetuximab)，即有RAS野生型的患者对EGFR抗体有效，KRAS突变的患者效果不显着。德国的Merck在这个方向最积极。与Sysmex合作开发OncoBEAM检测仪器用于KRAS临床伴随检测，与组织活检的一致性达到>92%[8]。与Biocartis合作开发傻瓜型诊断一体化仪器（研究用）。只要把1mL血清加入到检测仪器中，130 分钟后自动出结果。号称10岁的小孩就可以操作。

除了伴随诊断，KRAS血检还可以用于药物治疗效果跟踪，指导用药，停药决定。如有报道的病例，EGFR抗体使用造成野生型的RAS发生突变，疾病进展后建议停止使用EGFR抗体，并使用其它治疗方法，等KRAS突变检测呈阴性后，可以继续使用EGFR抗体。这些方便，灵敏，对患者友好的RAS突变状态的动态监测，正是血检的优势所在，受到医生患者的积极响应。

虽然KRAS突变在非小细胞肺癌中占的比例高达25%以上，但由于没有有效的直接靶向KRAS的药物可以使用，所以KRAS突变信息在肺癌患者中对治疗的指导意义当前还很有限，好在肿瘤免疫疗法对KRAS突变应答率还不错。

最近在EORTC-NCI-AACR会议上报道的肠胃癌（GISTs）的一期临床过程中，完美地应用了液体活检的手段，跟踪cKIT和PDGFR的耐药突变动态变化。Imatinib（Gleevec）在CML有着耐久神药的称号，但在在肠胃的靶向突变上，却很快就产生了耐药突变。BLU-285和DCC-2618就是设计出来的二代，用来克服一代的耐药突变。常规血样液体活检能够及时，准确的追踪临床药物的使用效果[9]。看来，以后靶向耐药临床试验的液体活检有逐渐要成为标准检测之一的倾向。

血检cfDNA的其它应用前景

随着cfDNA技术的不断进步和成熟，用常规血液cfDNA样品来大规模筛查罕见驱动致癌突变获得了很好的机会，比如TRKA， B， C 融合突变在几乎大多数肿瘤类型中都有表达，但比例都不高[10]。这样，即使有很好的TRK小分子抑制剂，因为病人招募非常困难，新药开发进展缓慢。如果常规血检panel能够得到推广，新药临床开发可以大大提速。其它的例子象在非小细胞肺癌，c-RET的融合突变有1-2%，c-MET 外显子14剪切突变在肺癌有2-4%等，都是驱动致癌突变，却因为病人数量相对较少，严重阻碍了小分子药物临床开发进展与获批[11]。

乳腺癌中的PIK3CA 突变，黑素瘤中的BRAF（V600E）也是液体血检的研究热点。

用血清cfDNA的手段来检测基因的过量表达还非常困难。很多时候，cfDNA的表达量与肿瘤组织相应蛋白表达含量不成正比。像乳腺癌的HER2检测可能还要更多的依赖于传统组织检测手段。 

至于许多其他的肿瘤类型，特别是致癌突变基因不明确，靶向药物缺乏的情况下，血检的重要性和迫切性还不是很明显。

随着肿瘤免疫疗法临床数据的不断积累，大规模的NGS血检数据也许可以辅助预判免疫反应的概率，用来指导潜在的用药组合。这应该是较为遥远的目标。

最后，最具社会价值的应用之一是癌症特别是肺癌的早期诊断了。肺癌总体5年生存率只有18%。如果能够早期发现，一期的五年生存率高达45-49%，二期也有30%。三期14%，四期只有1% (美国癌症协会网站统计，2000年的少有的早期数据，现在肺癌晚期生存率应该提高了很多，见[11])。由于肺癌属于看不见，摸不着的肿瘤类型，同时早期发病时症状也不明显，导致多数患者确诊时已是晚期。肿瘤液体血检早期诊断还处在起步阶段，也是Grail要努力的方向。当然，泼冷水的也大有人在，批评他们好高骛远，搞高大上全， 不如来点实在的[1]。我觉得这是一个有前景的方向，特别值得慈善基金投资。